PRAKTIKUM PEWARNAAN BAKTERI GRAM

PEWARNAAN BAKTERI

A.     TUJUAN

1.   Mempelajari dasar kimia pewarna Gram dan pewarna Spora

2.  Mempelajari prosedur untuk membedakan bakteri menjadi golongan gram positif dan negatif

3.  Mempelajari prosedur membedakan bakteri antara pembentuk spora dan sel.

B.      TEORI

Pewarnaan Gram

Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Bakteri terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bilakomponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar.

Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998).

Sel-sel mikroorganisme yang tidak diwarnai umumnya tampak hampir tembus pandang (transparan) bila diamati dengan mikroskop cahaya biasa hingga sukar dilihat karena sitoplasma selnya mempunyai indeks bias yang hampir sama dengan indeks bias lingkungannya yang bersifat cair. Kontras antara sel dan latar belakangnya dapat dipertajam dengan cara mewarnai sel-sel tersebut dengan zat-zat warna (Hadioetomo, 1990).

Pada umumnya, olesan bakteri terwarnai mengungkapkan ukuran, bentuk, susunan dan adanya struktur internal seperti spora dan butiran zat pewarna khusus diperlukan untuk melihat bentuk kapsul ataupun flagella, dan hal-hal terperinci tertentu di dalam sel. Zat pewarna adalah garam yang terdiri atas ion positif dan ion negatif, yang salah satu diantaranya berwarna (Volk dan Whleer, 1998).
Sel bakteri dapat teramati dengan jelas jika digunakan mikroskop dengan perbesaran 100x10 yang ditambah minyak imersi. Jika dibuat preparat ulas tanpa pewarnaan, sel bakteri sulit terlihat. Pewarnaan bertujuan untuk memperjelas sel bakteri dengan menempelkan zat warna ke permukaan sel bakteri. Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatka. Zat warna yang digunakan bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif. Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena muatan negatif banyak banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam antara lain Crystal Violet, Methylene Blue, Safranin, Base Fuchsin, Malachite Green dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll (Irawan, 2008).

Banyak senyawa organik berwarna (zat warna) digunakan untuk mewarnai mikroorganisme untuk pemeriksaan mikroskopik dan telah dikembangkan prosedur pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :

§         Mengamati dengan baik morfologi mikroorganisme secara kasar.

§         Mengidentifikasi bagian-bagian struktural sel mikroorganisme.

§         Membantu mengidentifikasi atau membedakan organisme yang serupa.

Langkah-langkah utama dalam persiapan spesimen mikroba untuk pemeriksaan mikroskopik adalah (Pelczar, 1986) :

§         Penempatan olesan atau lapisan spesimen pada kaca objek.

§         Fiksasi olesan pada kaca objek.

§         Aplikasi pewarna tunggal (pewarnaan sederhana) atau serangkaian larutan pewarna atau reagen (pewarnaan diferensial.

Pewarnaan atau pengecatan terhadap mikroba, banyak dilakukan baik secara langsung (bersama bahan yang ada) ataupun secara tidak langsung (melalui biakan murni). Tujuan dari pewarnaan tersebut adalah pewarnaan untuk (Suriawiria, 1985) :

§         Mempermudah melihat bentuk jasad baik bakteri, ragi ataupun fungi.

§         Memperjelas ukuran dan bentuk jasad

§         Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan juga struktur dalam jasad.

§         Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik dan kimia yang ada akan dapat diketahui.

Pewarna yang digunakan pada umumnya berbentuk senyawa kimia khusus yang akan memberikan reaksi kalu mengenai bagian tubuh jasad. Karena pewarnaan tersebut berbentuk ion yang bermuatan positif ataupun negative. Sel bakteri bermuatan mendekati negatif kalau dalam keadaan pH mendekati netral. Sehingga kalau kita memberikan pewarnaan yang bermuatan positif ataupun negatif (Suriawiria, 1985).

Pewarnaan Sederhana (Pewarnaan Positif). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas object glass yang kemudian difiksasi. Jangan menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat, tapi jika suspensi bakteri terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan saat mencari bakteri dengan mikroskop. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada object glass tanpa merusak struktur selnya (Campbell dan Reece, 2005).

Pewarnaan Negatif. Beberapa bakteri sulit diwarnai dengan zat warna basa. Tapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif. Zat warna tidak akan mewarnai sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan dengan latar belakang hitam (Campbell dan Reece, 2005). Setelah dilihat di mikroskop, maka akan tampak bentuk sel bakteri. Berikut merupakan berbagai bentuk sel bakteri (Anonim, 2008).

Pewarnaan Gram adalah pewarnaan diferensial yang sangat berguna dan paling banyak digunakan dalam laboratorium mikrobiologi, karena merupakan tahapan penting dalam langkah awal identifikasi. Pewarnaan ini didasarkan pada tebal atau tipisnya lapisan peptidoglikan di dinding sel dan banyak sedikitnya lapisan lemak pada membran sel bakteri. Jenis bakteri berdasarkan pewarnaan gram dibagi menjadi dua yaitu gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang tebal dan membran sel selapis. Sedangkan baktri gram negatif mempunyai dinding sel tipis yang berada di antara dua lapis membran sel (Irawan, 2008). Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam pewarnaan gram adalah sebagai berikut (Irawan, 2008):

a.         Fase yang paling kritis dari prosedur di atas adalah tahap dekolorisasi yang mengakibatkan CV-iodine lepas dari sel. Pemberian ethanol jangan sampai berlebih yang akan menyebabkan overdecolorization sehingga sel gram positif tampak seperti gram negatif. Namun juga jangan sampai terlalu sedikit dalam penetesan etanol (underdecolorization) yang tidak akan melarutkan CV-iodine secara sempurna sehingga sel gram negatif seperti gram positif.

b.         Preparasi pewarnaan gram terbaik adalah menggunakan kultur muda yang tidak lebih lama dari 24 jam. Umur kultur akan berpengaruh pada kemampuan sel menyerap warna utama (CV), khususnya pada gram positif. Mungkin akan menampakkan gram variabel yaitu satu jenis sel, sebagian berwarna ungu dan sebagian merah karena pengaruh umur. Walaupun ada beberapa species yang memang bersifat gram variabel seperti pada genus Acinetobacter dan Arthrobacter.

Pewarnaan Endospora. Anggota dari genus Clostridium, Desulfomaculatum dan Bacillus adalah bakteri yang memproduksi endospora dalam siklus hidupnya. Endospora merupakan bentuk dorman dari sel vegetatif, sehingga metabolismenya bersifat inaktif dan mampu bertahan dalam tekanan fisik dan kimia seperti panas, kering, dingin, radiasi dan bahan kimia. Tujuan dilakukannya pewarnaan endospora adalah membedakan endospora dengan sel vegetatif, sehingga pembedaannya tampak jelas (Irawan, 2008).

Endospora tetap dapat dilihat di bawah mikroskop meskipun tanpa pewarnaan dan tampak sebagai bulatan transparan dan sangat refraktil. Namun jika dengan pewarnaan sederhana, endospora sulit dibedakan dengan badan inklusi (kedua-duanya transparan, sel vegetatif berwarna), sehingga diperlukan teknik pewarnaan endospora. Berikut merupakan beberapa tipe endospora dan contohnya (Irawan, 2008)

C.      ALAT DAN BAHAN

Adapun alat dan bahan yang digunakan pada pengamatan ini antara lain :

1.      Alat

a)   Lampu bunsen

b)   Hotplate

c)    Jarum inokulasi ujung bulat

d)   Kaca objek

e)   Baki pewarna

f)     Mikroskop

2.      Bahan

a)   Kultur bakteri hasil isolasi

b)   Bacillus cereus dalam medium agar nutrisi miring berumur 24 jam

c)    Kristal violet

d)   Gram iodin

e)   Alkohol 95%

f)     Safranin

g)   Malakit hijau

h)   Kertas hisap

i)     Kertas lensa.

D.     CARA KERJA

Pewarnaan Gram

1.        Membersihkan kaca objek

2.        Dengan menggunakan teknik steril, siapkan apusan bakteri hasil isolasi atau kultur bakteri lain yang telah disiapkan dengan cara meneteskan air pada kaca objek dan transfer isolat bakteri ke dalam tetesan tersebut kemudian campurkan dan sebarkan dengan gerakan memutar menggunakan jarum inokulasi.

3.        Membiarkan apusan mengering di udara, kemudian memfiksasi panas dengan cara melalukan kaca objek di atas api bunsen.

4.        Mengaliri dengan kristal violet dan diamkan selama 1 menit

5.        Mencuci dengan air keran

6.        Mengaliri apusan mordan gram iodin atau lugol dan membiarkan selama 1 menit

7.        mendekolorisasi dengan alkohol 95%. Memperhatikan pada saat dekolorisasi. Menambahkan reagen setetes demi setetes sehingga kristal violet tidak tercuci lagi dari apusan.

8.        Mencuci dengan aquades.

9.        Memberi pewarna kontras dengan safranin selama 45 detik.

10.    Mencuci dengan aquades

11.    Mengeringkan diantara kertas kering  saring/kertas hidup dan selanjutnya mengamati dengan mikroskop.

12.    Membuat gambar hasil pengamatan dan membedakan atas morfologi dan susunannya, serta mengamati warna sel terwarnai.

Pewarnaan Spora

1.      Membersihkan kaca objek

2.      Dengan menggunakan teknik steril kemudian menyiapkan apusan bakteri Bacillus cereus dengan meneteskan air pada kaca objek dan transfer isolat bakteri kedalam tetesan tersebut kemudian mencampurkan dan menyebarkan dengan gerakan memutar menggunakan jarum inokulasi.

3.      Membiarkan mengering di udara

4.      Mengaliri apusan dengan malakit hijau dan meletakkan pada hotplate panas, membiarkan di atas penangas selama 2 menit. Menjaga jangan sampai pewarna habis menguap dengan cara meneteskan pewarna secukupnya.

5.      Mengambil preparat dari hotplate, mendinginkan dan mencuci dengan cara meneteskan pewarna secukupnya

6.      Mewarnai dengan perwarna kontras safranin selama 30 detik

7.      Mengeringkan diantara kertas saring/kertas hisap, mengamati di bawah mikroskop

8.      Membuat gambar bakteri pada perbesaran yang sesuai, kemudian menyatakan letak endospora di dalam sel vegetatif

9.      Menyatakan warna spora dan sel vegetatif.

E.      HASIL PENGAMATAN

F.       PEMBAHASAN

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah salah satu teknik pewarnaan yang paling penting dan luas yang digunakan untuk mengidentifikasi bakteri. Dalam proses ini, olesan bakteri yang sudah terfiksasi dikenai larutan-larutan berikut : zat pewarna kristal violet, larutan yodium, larutan alkohol (bahan pemucat), dan zat pewarna tandingannya berupa zat warna safranin atau air fuchsin. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri yang terwarnai dengan metode ini dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif.

Bakteri Gram positif akan mempertahankan zat pewarna kristal violet dan karenanya akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat pewarna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna tandingannya yaitu dengan zat pewarna air fuchsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya.

Pengecatan gram termasuk pengecatan diferensial yang digunakan untuk membedakan bakteri gram negative dan bakteri gram positif. Pada pengecatan ini digunakan 4 jenis bakteri yaitu Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Isolat X dan Eshericia coli. Pengecatan ini menggunakan 4 jenis larutan yaitu Kristal violet sebagai cat utama, larutan iodine sebagai pengintensifan cat utama, alcohol asam untuk pencucian dan safranin sebagai cat penutup. Berdasarkan percobaan diperoleh Bacillus cereus dan Staphylococcus aureus bersifat gram positif yang berarti bakteri dapat mengikat dengan kuat cat utama cristal violet berwarna ungu, pada saat bakteri Gram positif ditambahkan dengan kristal violet maka gram positif akan mengabsorbsi larutan tersebut hanya pada dinding sel, dengan pemberian larutan lugol maka kristal violet akan masuk sampai ke inti sel, pemberian alkohol menyebabkan pori-pori dinding sel mengecil sehingga warna ungu tertahan di dalam sel disebabkan oleh rendahnya kandungan lipid. Sedangkan bakteri Eschericia coli dan Isolat X bersifat gram negative karena tidak dapat mengikat kuat cat utama dan dapat diwarnai oleh cat lawan yakni merah dari pewarna safranin.

Perbedaan gram (+) dan gram (-)

Sifat Gram (+) Gram (-)

§         Komposisi Kandungan lipid rendah Kandungan lipid tinggi

§         Ketahanan terhadap penisilin Lebih sensitif Lebih tahan

§         Penghambatan warna Lebih dihambat Kurang dihambat

§       Ketahanan terhadap fisik Lebih tahan Kurang tahan

§       Kebutuhan Nutrien Kompleks Relatif

Pada pengamatan ini dilakukan 4 tahap dalam pengecatan yaitu :

1.      Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.

2.      Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.

3.      Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.

4.      Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

Bakteri gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.
Banyak spesies bakteri gram-negatif yang bersifat patogen, yang berarti mereka berbahaya bagi organisme inang. Sifat patogen ini umumnya berkaitan dengan komponen tertentu pada dinding sel gram-negatif, terutama lapisan lipopolisakarida (dikenal juga dengan LPS atau endotoksin)

Bakteri gram-positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram-negatif akan berwarna merah atau merah muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri.Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan.

Adapun cara kerja pewarnaan ini yaitu pertama dengan mediakan kaca benda yang bersih, lalu lewatkan diatas nyala api bunsen, meneteskan setetes aquades steril diatas kaca benda tersebut secara aseptik ambilah inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu letakkan diatas tetesan aquades itu, kemudian ratakan perlahan-lahan ambil kaca benda yang tegak sehingga apusan menjadi tipis dan merata. Biarkan sampai kering fiksasi dengan cara melewatkan apusan tersebut diatas nyala api dengan cepat letakkan apusan diatas kawat penyangga yang berada diatas mangkuk pewarna. Lalu teteskan larutan kristal violet pada apusan dan biarkan selama 30-60 detik cuci warna dasar dengan akuades mengalir, kemudian mengeringkan teteskan larutan iodin pada apusan, membiarkan selama 30-60 detik cuci larutan iodin dengan akuades mengalir. teteskan larutan safranin, biarkan selama 30-60 detik cuci dengan akuades mengalir, lalu mengeringkan dan mengamati dengan mikroskop gambar bentuk morfologi.

G.     KESIMPULAN

Berdasarkan percobaan yang dilakukan maka dapat disimpulkan bahwa :

1.         Pewarnaan mikroorganisme dapat dilakukan dengan cara yaitu dengan pengecatan untuk melihat bentuk dan struktur sel bakteri dengan menggunakan jenis pewarna seperti safranin atau kristal violet, pewarnaan digunakan untuk membedakan antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna.

2.         Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.

H.     LITERATUR

Anonim, 2009. Teknik Pewarnaan Mikroorganisme. http://firebiology07.wordpress.com/2009/04/19/teknik-pewarnaan-mikroorganisme/  diakses tanggal 6 Mei 2011)

Mushof Aditya, 2010. Pewarnaan Bakteri. (http://www.google.co.id/imgres?imgurl=http://4.bp.blogspot.com/_emC5m-ppVSs/S0AtNUHYCtI/AAAAAAAAAIM/In6BVAz_j9A/s320/salmonella-thy.jpg&imgrefurl=http://mushoffaditya.blogspot.com/2010/01/teknik-pewarnaan-bakteri.html&usg=__InDIzZ3NPc8sYOJqXRNWvYY7zto=&h=256&w=320&sz=17&hl=id&start=6&zoom=1&itbs=1&tbnid=seTuFoFiwwYclM:&tbnh=94&tbnw=118&prev=/search%3Fq%3Dpewarnaan%2Bbakteri%26hl%3Did%26biw%3D1366%26bih%3D667%26gbv%3D2%26tbm%3Disch&ei=7DTHTb7EMIj4vwPS4KWqAQ diakses tanggal 6 Mei 2011)

Rustan, 2009. Teknik Pewarnaan Organisme.  (http://rustan-biologiofscience.blogspot.com/2009/08/teknik-pewarnaan-mikroorganisme.html diakses tanggal 6 Mei 2011)

Wikipedia, 2011. Pewarnaan Gram. (http://id.wikipedia.org/wiki/Pewarnaan_Gram diakses tanggal 6 Mei 2011)